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凋亡相關因子elisa試劑盒反應流程常規(guī)程序

發(fā)表時間:2022-09-16
凋亡相關因子elisa試劑盒反應流程常規(guī)程序:
 
將PCR反應所需的成分配置完后,在PCR儀上于94-96℃預加熱幾十秒至幾分鐘,使模板DNA充分變性,然后進入擴增循環(huán)。在每一個循環(huán)中,先于94℃保持30秒鐘使模板變性,然后將溫度降到復性溫度(一般50-60℃之間),一般保持30秒鐘,使引物與模板充分退火;在72℃保持1分鐘(擴增1kb片段),使引物在模板上延伸,合成DNA,完成一個循環(huán)。重復這樣的循環(huán)25~35次,使擴增的DNA片段大量累積。最后,在72℃保持3-7min,使產物延伸完整,4℃保存。
 
2.復性(退火)和延伸溫度
 
復性的溫度是PCR擴增是否順利的關鍵因素,通常在50-60℃之間。具體的溫度主要由引物的Tm值決定。延伸溫度絕大多數(shù)設定為72℃。如果復性的溫度很高,可以將延伸溫度和復性溫度設置成同一溫度,變成二步法PCR。
 
3.反應時間
 
變性步驟一般使用30秒鐘,如果模板的G+C含量較高,或直接用細胞做模板,變性時間可適當延長。復性時間有30秒種一般是足夠的。延伸時間由擴增產物的大小決定,一般采用1kb用1分鐘來保證充足的時間。
 
4.循環(huán)次數(shù)
 
循環(huán)次數(shù)主要與模板的起始數(shù)量有關,在模板拷貝數(shù)為104~105數(shù)量級時,循環(huán)數(shù)通常為25~35次。
 
平臺效應(plateaueffect):PCR擴增過程后期會出現(xiàn)的產物的積累按減弱的指數(shù)速率增長的現(xiàn)象。原因:底物和引物的濃度已經(jīng)降低,dNTP和DNA聚合酶的穩(wěn)定性或活性降低,產生的焦磷酸會出現(xiàn)末端產物抑制作用,非特異性產物或引物的二聚體出現(xiàn)非特異性競爭作用,擴增產物自身復性,高濃度擴增產物變性不徹底。
 
5.PCR反應液的配制
 
PCR反應體系的配置方式有時也會影響反應的正常進行。常規(guī)方法與其它酶學反應一樣,在最后加入DNA聚合酶。早期的PCR儀沒有帶加熱的蓋子,要求在反應液上覆蓋一層礦物油,防止水分蒸發(fā)。
 
對于使用具3’-5’外切活性的高溫DNA聚合酶時,有時會擴增不出產物。在遇到這個問題時,如果將反應成分分開配制,A管含模板、引物和dNTP,以及調整體積的H2O,B管含緩沖液、DNA聚合酶和水,然后再將兩管溶液混合起來,可較好地克服這個問題。
 

按照常規(guī)的方法配制反應體系,有時會出現(xiàn)非特異性擴增的問題。熱啟動(hotstart)PCR操作方式可較好解決這一問題。將dNTP、緩沖液,Mg2+和primer先配制好,然后加入一粒蠟珠(如AmpliWaxPCRQam100),加熱熔化,再冷卻,使蠟將溶液封住,最后加入模板和DNA聚合酶等剩余成分。只有當PCR反應進入高溫階段后,蠟層熔化,所有反應成分才會混合在一起。

人 PIGR ELISA配對抗體
人 PDGFRA / CD140a ELISA配對抗體
人 IL3RA / CD123 ELISA配對抗體
人 CTLA4 / CD152 ELISA配對抗體
人 MSR1 / CD204 ELISA配對抗體
小鼠 CD14 ELISA配對抗體
甲型流感 H1N1 (A/Puerto Rico/8/1934) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) ELISA配對抗體
人 SerpinG1 / C1 inhibitor / C1IN ELISA配對抗體
人 METTL1 ELISA配對抗體
人 E-Selectin / CD62e / SELE ELISA配對抗體
人 CD21 / C3DR ELISA配對抗體
人 CD55 / DAF ELISA配對抗體
人 CD8A / MAL ELISA配對抗體
人 CD50 / ICAM-3 ELISA配對抗體
人 CD3d / CD3 delta ELISA配對抗體
人 IL18R1 / CD218a ELISA配對抗體
人 Complement C1s ELISA配對抗體
人 Vitronectin / VTN ELISA配對抗體
人 ECM1 ELISA配對抗體
人 Transferrin / TF ELISA配對抗體
甲型流感 H9N2 血凝素 (Hemagglutinin / HA) ELISA配對抗體
甲型流感 H3N2 (A/Brisbane/10/2007) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) ELISA配對抗體
人類免疫缺陷病毒Ⅰ型 HIV-1 p24 / Capsid Protein p24 ELISA配對抗體
人 TNFR1 / CD120a / TNFRSF1A ELISA配對抗體
人 Endoglin / CD105 / ENG ELISA配對抗體
人 IL1R2 / IL1RB / CD121b ELISA配對抗體


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