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概述：
熒光定量PCR的基本原理就是在PCR擴增過程中，隨著PCR循環(huán)數(shù)的遞增，PCR產(chǎn)物不斷積累，熒光信號也會相應(yīng)的增加，這樣就可以通過熒光強度的變化來對PCR反應(yīng)進行實時的監(jiān)測。產(chǎn)品僅供科研使用本公司根據(jù)您的科研需求可以提供SYBR Green染料法和TaqMan探針法。通過對DNA或RNA的熒光定量PCR監(jiān)測, 實現(xiàn)基因的相對定量、定量和定性分析。

實時熒光定量PCR：
實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：
1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進入真正的指數(shù)擴增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內(nèi)擴增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。
外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性*的定量方法，已得到全世界的公認(rèn)，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。
探針熒光定量PCR試劑盒原理分析如下圖：

使用方法：
一、液化沙雷菌探針法熒光定量PCR試劑盒稀釋PCR陽性對照（以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）
1. 注意：由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的DNA片段作為陽性對照。
2. 標(biāo)記6個離心管，分別為7，6，5，4，3，2。
3. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液（用帶芯槍頭，下同）。
4. 在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
5. 換槍頭，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
6. 換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL的陽性對照到5號管中，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。
7. 重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備
8. 如果有N個樣品，必須設(shè)置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?/span>10μL上步制備的PCR陽性對照的第4號（濃度為1×10E4 拷貝/μL，10μL相當(dāng)于1萬拷貝）或第5號（濃度為1×10E5 拷貝/μL，10μL相當(dāng)于10萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品，則PC和NC的體積也必須是200μL。
9. 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒DNA提取試劑盒兼容。
三、設(shè)置qPCR反應(yīng)（20 μL體系，在樣品制備室進行）
10. 如果只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照，6個用于PCR陽性對照。如果做2-3次重復(fù)，則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加2或3倍。
11. 產(chǎn)品僅用于科研在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后加）

熒光定量PCR服務(wù)：
產(chǎn)品僅供科研使用簡介：實時熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國Applied Biosystems公司推出，該技術(shù)不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前該技術(shù)已被廣泛用于檢測細(xì)胞mRNA表達(dá)量的變化；比較不同組織的mRNA表達(dá)差異；驗證基因芯片，siRNA干擾的實驗結(jié)果等。我公司為您提供全套實時熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)，全部實驗皆使用進口試劑完成，主要定量PCR儀器。
1、熒光定量PCR服務(wù)要求：
（01）請您提供新鮮的且盡量多的材料；或直接提供純化好的總RNA（大于 5 ug/樣品）；或直接提供純化好的DNA（大于 5 ug/樣品）。
（02）請?zhí)峁┮阎娜L基因序列。
（03）請?zhí)峁┍M可能詳細(xì)的背景資料：DNA/RNA 來源等
2、熒光定量PCR操作程序
（01）引物（探針）設(shè)計與合成。
（02）提取DNA/RNA，樣本逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。
（03）進行Real Time PCR實驗，進行實驗結(jié)果分析。
（04）實驗完成后，提供完整的實驗報告（含軟件分析結(jié)果）及引物等實驗材料。
3、熒光定量PCR的收費標(biāo)準(zhǔn)：
  我公司根據(jù)客戶的樣品數(shù)量進行不同的收費標(biāo)準(zhǔn)。
S-180細(xì)胞，腹水瘤細(xì)胞 人細(xì)胞,CRL-2780細(xì)胞 非洲綠猴腎細(xì)胞;VERO順式(2,3)-二氫丁苯那嗪質(zhì)量規(guī)格：美國進口cis (2,3)-Dihydro Tetrabenazine

大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞;IEC-6反式(2,3)-二氫丁苯那嗪質(zhì)量規(guī)格：美國進口trans (2,3)-Dihydro Tetrabenazine

SCARB1 Others Mouse 小鼠 SCARB1 / CD36L1 / CLA-1 人細(xì)胞裂解液 (陽性對照) 氟米*基乙酸質(zhì)量規(guī)格：美國進口Flumethasone pivalate

上皮細(xì)胞培養(yǎng)基MEpiCM-prf愛維莫潘質(zhì)量規(guī)格：美國進口Alvimopan

HA Others H7N2 甲型 H7N2 (A/ruddy turnstone/New Jersey/563/2006) 血凝素 (Hemagglutinin / HA) 桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞裂解液 (陽性對照) N-去甲基拓?fù)涮婵蒂|(zhì)量規(guī)格：美國進口N-Desmethyl Topotecan
人骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞HSkMSC二甲基亞砜(多肽合成專用)質(zhì)量規(guī)格：多肽合成專用 Dimethyl sulfoxide

HIT-T15細(xì)胞，倉鼠beta胰島細(xì)胞 人癌細(xì)胞,MCF-7B細(xì)胞 小鼠胚胎成纖維細(xì)胞MEF二甲基亞砜(藥用級)質(zhì)量規(guī)格：藥用級 Dimethyl sulfoxide

牛胚氣管細(xì)胞;EB (NBL-4)二甲基亞砜(ACS,光譜級)質(zhì)量規(guī)格：ACS,光譜級Dimethyl sulfoxide

LGMN Others Mouse 小鼠 LGMN 人細(xì)胞裂解液 (陽性對照) 乙二醇(光譜 ,≥99%)質(zhì)量規(guī)格：光譜 ,≥99%Ethylene glycol

CM-H108人表皮色素細(xì)胞完全培養(yǎng)基100mL甘油(for spectroscopy,≥99.5%)質(zhì)量規(guī)格：for spectroscopy,≥99.5%Glycerol in water for HPLC verification
IL10RB Others Mouse 小鼠 IL10RB / IL10R2 人細(xì)胞裂解液 (陽性對照) 菊芬，英文名或英文縮寫：Inulin，級別：生物技術(shù)級，98%，規(guī)格：5毫克

KYSE510 (s)-(+)-α-氧基-α-(三拂基)本酰錄 (S)-(+)-cLPHc-MqTHOXY-cLPHc-TRIFLUOROMqTHYLPHqNYLcCqTYL CHLORIDq 0442-33-4

Ca Ski人腸轉(zhuǎn)移細(xì)胞 Ca human cervical carcinoma Ski cells in iestinal metastasis RPMI-1640(GIBCO)+10%FBSL(-)木糖 L-XYLOSq 609-06-3

FLT3LG Protein Human 重組人 FLT3L / Flt3 ligand / FLT3LG 蛋白 (His 標(biāo)簽)BESTATIN貝他定(本丁抑制素)超級10MG58970-76-6Frozen

小鼠纖維細(xì)胞(MLF)(5×105) MiaPaCa-2, 人細(xì)胞 Human16052-06-5N-()-N’-丙磺酸 (EPPS)EPPS
液化沙雷菌探針法熒光定量PCR試劑盒FGF14 Protein Human 重組人 FGF14 / SCA27 蛋白 (isoform 1B)DL-丙氨酰-DL-丙氨酸DL-Ala-DL-Ala質(zhì)量規(guī)格：0.97

BNL 1ME A.7R.1(小鼠肝上皮細(xì)胞) 5×106cells/瓶×2 人腸微內(nèi)皮細(xì)胞HIMECN-乙酰-DL-谷氨酸Ac-DL-Glu-OH質(zhì)量規(guī)格：>98%,BR

人表皮角質(zhì)細(xì)胞-胎兒HEK-fDL-α-氨基己二酸,2-氨基己二酸DL-a-Aminoadipic acid質(zhì)量規(guī)格：>97%,混旋

VIPR2 Others Human 人 VIPR2 / VPAC2 人細(xì)胞裂解液 (陽性對照) DL-半胱氨酸鹽酸鹽，一水DL-Cysteine·HCl·H2O質(zhì)量規(guī)格：0.98

兔眼Tenon's囊成纖維細(xì)胞;RYTFDL-胱氨酸鹽酸鹽DL-Cysteine hydrochloride質(zhì)量規(guī)格：>98%,BR
實驗過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物?？梢允?/span>DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此，擴增不同的基因需要設(shè)計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進入循環(huán)擴增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進行。zui好設(shè)立一個專用的PCR實驗室。
２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。